Título
Obtención y caracterización de bioconjugados de metotrexato para la producción de anticuerpos
Autor
LUIS FERNANDO LOPEZ VALDEZ
Nivel de Acceso
Acceso Abierto
Resumen o descripción
Los métodos analíticos para la identificación y cuantificación de metotrexato (MTX) se han
diversificado y mejorado notablemente. Entre todos ellos, los métodos inmunoenzimáticos se han
posicionado de manera sobresaliente debido a que son procedimientos que presentan prestaciones
analíticas importantes en términos de sensibilidad, especificidad y potencial para tratar un gran
número de muestras, a un costo relativamente inferior que aquéllas de índole instrumental. En este
trabajo, se abordó la obtención de bioconjugados proteicos del MTX (BSA, OVA y HRP) y su
caracterización, para ser utilizados como inmunorreactivos para la eventual producción de
anticuerpos e identificación de MTX en ensayos inmunoenzimáticos en plataforma sólida tipo ELISA.
Al objeto de realizar la conjugación proteica, se aprovecharon los carboxilatos disponibles en la
estructura del MTX y los grupos -NH2 libres de los restos de lisina en las proteínas correspondientes.
Etapa que implicó la formación del éster activo de MTX utilizando 1.3 equivalentes de carbonato de
N,N’-disuccimidilo y 3.8 equivalentes de trietilamina en DMF anhidra. La obtención de los
conjugados inmunizantes de mtx-C-BSA, de ensayo mtx-C-OVA y de señalización mtx-C-HRP, se
prepararon a partir de disoluciones acuosas de la proteína correspondiente, en buffer de carbonatos
50 mM pH 9.6 y la adición del éster activo del hapteno del MTX. La determinación de la carga
hapténica se realizó por UV/Vis y espectrometría de masas MALDI-TOF para cada uno de los
bioconjugados resultando: 5.5 haptenos/ BSA que se utilizó como bioconjugado de inmunización,
3.0 haptenos/OVA para emplearse como conjugado de tapizado, y finalmente una relación de un
hapteno por HRP, mismo que se empleó como trazador enzimático. Se aplicó un protocolo de
inmunización en conejo hembra New Zealand blanco utilizando el bioconjugado inmunizante de
mtx-C-BSA, y el suero policlonal se valoró a través de ensayos ELISA competitivos tanto en formato
directo como indirecto que permitieron evaluar la afinidad de los anticuerpos policlonales hacia
MTX con valores de IC50 del orden 3 nM. De esta manera, se comprobó la viabilidad de los
bioconjugados proteicos del MTX preparados. No obstante, a las cargas hapténicas bajas de los
bioconjugados preparados, se accedió satisfactoriamente a un lote de anticuerpos policlonales de
conejo que exhibieron curvas de inhibición, con valores de IC50 cercanos a 3 nM permitiendo
encontrar las condiciones óptimas para establecer un inmunoensayo c-ELISA en formato indirecto
para la identificación del metotrexato en una matriz acuosa.
Producción Científica de la Universidad Autónoma de Zacatecas UAZ
Fecha de publicación
diciembre de 2019
Tipo de publicación
Tesis de maestría
Recurso de información
Formato
application/pdf
Idioma
Español
Audiencia
Público en general
Repositorio Orígen
Repositorio Institucional Caxcán
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