Título

CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y ESTRUCTURAL DE UNA LIPASA DE Vibrio parahaemolyticus CAUSANTE DE SINDROME DE MORTALIDAD TEMPRANA EN CAMARÓN BLANCO

Autor

CRISTOBAL JOEL GONZALEZ PEREZ

Colaborador

KARINA DALILA GARCIA OROZCO (Director)

CARMEN ARMINDA CONTRERAS VERGARA (Asesor de tesis)

ALONSO ALEXIS LOPEZ ZAVALA (Asesor de tesis)

ADRIANA TERESITA MUHLIA ALMAZAN (Asesor de tesis)

ROGERIO RAFAEL SOTELO MUNDO (Asesor de tesis)

Nivel de Acceso

Acceso Abierto

Resumen o descripción

En 2013 en México, se presentó una grave disminución en la producción de

camarón blanco Litopenaeus vannamei, la cual fue asociada a la presencia de

cepas patógenas de la bacteria Vibrio parahaemolyticus. Estas mortalidades se

asocian al síndrome de mortalidad atípica (early mortality syndrome o EMS,

acute hepatopancreatic necrosis disease o AHPND). En un trabajo previo se

estudió el genoma de dos cepas de Vibrio, una patógena y una inocua para el

camarón. En dichos genomas se identificaron enzimas lipasas, de las cuales se

seleccionó una para su estudio y caracterización, designada LipVp (Lipasa de

Vibrio parahaemolyticus). Las lipasas confieren a las bacterias la capacidad de

utilizar lípidos como única fuente de carbono e incluso pueden tomar parte en la

virulencia de éstas. Después de seleccionar a LipVp se alineó contra otras

lipasas y se modeló con el algoritmo PHYRE2, encontrándose mayor similitud

con una lipasa de Pseudomonas aeruginosa. En el modelo teórico de LipVp se

localizó la tríada catalítica conformada por S86, D233 e H255, 5 laminas-β

interconectadas con 10 hélices-α, el agujero oxianiónico y posibles aminoácidos

para formar un sitio de unión a calcio. Se diseñó un gen sintético con la

secuencia de LipVp el cual fue utilizado para transformar bacterias E. coli BL21

(DE3). La LipVp recombinante se obtuvo en cuerpos de inclusión, los cuales

fueron solubilizados con urea 8 M, posteriormente se dializó contra urea 4 M,

para proceder a purificar la proteína por cromatografía de afinidad a metales

(IMAC). El replegamiento de LipVp se realizó mediante diálisis con buffer

conteniendo: Tris-HCl 55 mM pH 8.0, NaCl 10.56 mM, KCl 0.44 mM,

polietilenglicol 3350 0.055%, MgCl2 2.2 mM, CaCl2 2.2 mM, L-arginina 550 mM,

glutatión reducido 0.5 mM y glutatión oxidado 0.05 mM. Se determinó una Km=

4.34 mM y una Vmax= 0.018 μM/min utilizando p-nitrofenil laurato como sustrato.

Por último, se comprobó la inhibición de la actividad enzimática con Orlistat®

(tetrahidro lipstatin: (S)-((S)-1-((2S,3S)-3-hexil-4-oxooxetan-2-il) tridecan-2-il) 2-

formamido-4-metil pentanoato). En conclusión se corroboró que LipVp codifica

para una lipasa funcional, donde se predice una estructura similar a otras.

Fecha de publicación

2016

Tipo de publicación

Tesis de maestría

Versión de la publicación

Versión publicada

Formato

application/pdf

Idioma

Español

Audiencia

Público en general

Repositorio Orígen

Repositorio institucional del CIAD, A.C.

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