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Identifying a carotenoid cleavage dioxygenase 4a gene and its efficient agrobacterium-mediated genetic transformationin Bixa orellana L.

MOHAN SANKARI HRIDYA HEMACHANDRAN AMIRTHA ANANTHARAMAN Subramanian Babu RENATA LOURDES BARBARA RIVERA MADRID George Priya Doss C DEVANAND P. FULZELE RAMAMOORTHY SIVA (2016)

Carotenoids are metabolized to apocarotenoids through the pathway catalysed by carotenoid cleavage oxygenases (CCOs). The apocarotenoids are economically important as it is known to have therapeutic as well as industrial applications. For instance, bixin from Bixa orellana and crocin from Crocus sativus are commercially used as a food colourant and cosmetics since prehistoric time. In our present study, CCD4a gene has been identified and isolated from leaves of B. orellana for the first time and named as BoCCD4a; phylogenetic analysis was carried out using CLUSTAL W. From sequence analysis, BoCCD4a contains two exons and one intron, which was compared with the selected AtCCD4, RdCCD4, GmCCD4 and CmCCD4a gene. Further, the BoCCD4a gene was cloned into pCAMBIA 1301, transformed into Agrobacterium tumefaciens EHA105 strain and subsequently transferred into hypocotyledons and callus of B. orellana by agro-infection. Selection of stable transformation was screened on the basis of PCR detection by using GUS and hptII specific primer, which was followed by histochemical characterization. The percent transient GUS expression in hypocotyledons and callus was 84.4 and 80 %, respectively. The expression of BoCCD4a gene in B. orellana was confirmed through RT-PCR analysis. From our results, the sequence analysis of BoCCD4a gene of B. orellana was closely related to the CsCCD4 gene of C. sativus, which suggests this gene may have a role in various processes such as fragrance, insect attractant and pollination.

Article

AGRO-INFECTION APOCAROTENOIDS BIXA ORELLANA CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE CCD4A RT-PCR BIOLOGÍA Y QUÍMICA BIOLOGÍA Y QUÍMICA

Distribución y rango de hospederos del virus de la leprosis de los cítricos (Citoplasmático y nuclear) transmitido por el complejo Brevipalpus spp. en los principales estados citrícolas de México.

HUGO ENRIQUE GONZALEZ GARCIA (2018)

Tesis (Maestría en Ciencias, especialista en Entomología y Acarología).- Colegio de Postgraduados, 2018.

La leprosis de los cítricos es ocasionada por dos tipos de virus, citoplasmático y nuclear, los cuales son transmitidos por un complejo de ácaros del género Brevipalpus. El objetivo del trabajo fue determinar la distribución de estos virus en las especies cítricas con mayor importancia económica en México y determinar si existe una relación de especificidad o preferencia entre la presencia del virus de la leprosis y los diversos hospederos, pues se tiene la hipótesis de que dichos virus se encuentran ampliamente distribuidos en el país, sobre especies de cítricos dulces. Para el estudio se realizaron muestreos de febrero a diciembre de 2017 en 16 Estados de la República Mexicana (Campeche, Chiapas, Hidalgo, Jalisco, Morelos, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí, Sinaloa, Tamaulipas, Tabasco, Veracruz y Zacatecas) en huertas de Citrus sinensis, C. aurantium, C. reticulata, C. latifolia, C. paradisi y C. reticulata, C. limmeta y C. aurantifolia. La presencia del virus se determinó con análisis de transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). En total se obtuvieron 106 muestras positivas para el virus citoplasmático y 81 para el nuclear y sus variantes. Los resultados indican que la distribución de esta enfermedad se ha incrementado de manera exponencial y se encuentra actualmente en cítricos dulces y agrios en todos los estados citrícolas del país que se evaluaron. _______________ HOST RANGE AND DISTRIBUTION OF THE CITRUS LEPROSIS VIRUS (CITOPLASMATIC AND NUCLEAR TYPES) TRANSMITTED BY THE SPECIES COMPLEX OF THE GENUS BREVIPALPUS IN THE MAIN CITRUS PRODUCERS STATES IN MEXICO. ABSTRACT: The citrus leprosis is caused by two viruses, cytoplamastic and nuclear; which are transmitted by mites within the genus Brevipalpus. Currently, these viruses have been mainly associated only with sweet citrus species. However, considering their current distribution, it is likely that other citrus species are also infected. Therefore, the aim of our study was to determine the distribution of these two viruses on the most important citrus species orchards in Mexico. For this, a systematic sampling was carried out from February to December 2017 in 16 states: Campeche, Chiapas, Hidalgo, Jalisco, Morelos, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí, Sinaloa, Tamaulipas, Veracruz and Zacatecas. The following citrus species were studied Citrus sinensis, C. aurantium, C. reticulata, C. latifolia, C. paradisi y C. reticulata, C. limmeta y C. aurantifolia. The presence of these viruses was determined using RT-PCR reactions. Overall, 106 samples were positive to CiLV-C and 81 to CiLV-N and its variants. Our results showed that the distribution of the citrus leprosis has increased greatly, infecting sweet and sour citrus species in all Mexican states sampled.

Master thesis

RT-PCR Enfermedad Cítricos Virus Disease Citrus Entomología y Acarología Maestría CIENCIAS AGROPECUARIAS Y BIOTECNOLOGÍA CIENCIAS AGRARIAS FITOPATOLOGÍA OTRAS

Identifying a carotenoid cleavage dioxygenase 4a gene and its efficient agrobacterium-mediated genetic transformationin Bixa orellana L.

MOHAN SANKARI HRIDYA HEMACHANDRAN AMIRTHA ANANTHARAMAN Subramanian Babu RENATA LOURDES BARBARA RIVERA MADRID George Priya Doss C DEVANAND P. FULZELE RAMAMOORTHY SIVA (2016)

Carotenoids are metabolized to apocarotenoids through the pathway catalysed by carotenoid cleavage oxygenases (CCOs). The apocarotenoids are economically important as it is known to have therapeutic as well as industrial applications. For instance, bixin from Bixa orellana and crocin from Crocus sativus are commercially used as a food colourant and cosmetics since prehistoric time. In our present study, CCD4a gene has been identified and isolated from leaves of B. orellana for the first time and named as BoCCD4a; phylogenetic analysis was carried out using CLUSTAL W. From sequence analysis, BoCCD4a contains two exons and one intron, which was compared with the selected AtCCD4, RdCCD4, GmCCD4 and CmCCD4a gene. Further, the BoCCD4a gene was cloned into pCAMBIA 1301, transformed into Agrobacterium tumefaciens EHA105 strain and subsequently transferred into hypocotyledons and callus of B. orellana by agro-infection. Selection of stable transformation was screened on the basis of PCR detection by using GUS and hptII specific primer, which was followed by histochemical characterization. The percent transient GUS expression in hypocotyledons and callus was 84.4 and 80 %, respectively. The expression of BoCCD4a gene in B. orellana was confirmed through RT-PCR analysis. From our results, the sequence analysis of BoCCD4a gene of B. orellana was closely related to the CsCCD4 gene of C. sativus, which suggests this gene may have a role in various processes such as fragrance, insect attractant and pollination.

Article

AGRO-INFECTION APOCAROTENOIDS BIXA ORELLANA CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE CCD4A RT-PCR BIOLOGÍA Y QUÍMICA

Identificación de virus asociados a la nochebuena de sol (Euphorbia pulcherrima Willd Ex Klotzch) en México

TANIA OCAMPO OCAMPO (2012)

Tesis (Maestría en Ciencias, especialista en Fitopatología).- Colegio de Postgraduados, 2012.

El Campo Experimental “Zacatepec”, del INIFAP, inició un programa de mejoramiento genético de plantas silvestres y semicultivadas de nochebuena (“nochebuena de sol”). Dicho programa requiere de la generación de una amplia base de datos fitosanitarios que permitan la liberación permanente de nuevas variedades e híbridos con tolerancia a las principales enfermedades. En México no hay con información sobre presencia de virus en nochebuena de sol, por lo que el objetivo de la presente investigación fue generar información de los virus asociados a esta planta. La identificación de estos patógenos se realizó mediante pruebas ELISA, inmunotiras y RT-PCR; adicionalmente, se inocularon plantas indicadoras y se hizo microscopia electrónica de transmisión. Con inmunotiras se detectaron los virus Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV) y Tomato spotted wilt virus (TSWV). La prueba DAS-ELISA confirmó la presencia de CMV, TMV y PnMV, pero no la del TSWV. Mediante RT-PCR se corroboró la infección de las plantas por TMV y PnMV. Las pruebas de transmisión a plantas indicadoras fueron negativas; y las células de hojas de nochebuena de sol con síntomas virales y que resultaron positivas a CMV y TMV con la prueba DAS-ELISA mostraron deformación y desorganización del sistema de tilacoides, y acumulación de lípidos y/o almidón. Con base en los análisis serológico y molecular se identifica por primera vez en México la presencia de PnMV en plantas de nochebuena de sol, siendo también un nuevo hospedero para el TMV. De acuerdo con la prueba DAS-ELISA, es posible considerar a la nochebuena de sol como un nuevo hospedante para el CMV. _______________ VIRUSES ASSOCIATED TO WILD POINSETTIA (Euphorbia pulcherrima Willd. Ex Klotzch) IN MEXICO. ABSTRACT: INIFAP Experimental Station in Morelos state started a genetic improvement program of wild and semi-cultivated poinsettia plants ("nochebuena de sol"). So, it is important to generate a phytosanitary database that allows the release of new varieties and hybrids tolerant to important diseases in poinsettia plants. The phytosanitary status of the “nochebuena de sol” plants is unknow in Mexico, so the objective of this research was to generate preliminary data about viruses associated to these materials. The identification of the pathogen was done by ELISA, immunostrips and RT-PCR, indicator plants inoculation, and transmission electron microscopy. The Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV) and Tomato spotted wilt virus (TSWV) were identified by immunostrips. The DAS-ELISA test confirmed the occurrence of CMV, TMV, and PnMV but not TSWV. The molecular diagnosis corroborated the presence of TMV and PnMV. The virus transmission tests to indicator plants were not successful. Parenchyma cells of will poinsettia leaves with viral symptoms and DAS-ELISA positive to CMV and TMV showed deformation and disruption of the thylakoid system as well as starch and / or lipid accumulation in chloroplasts. Based on the serological and molecular results, we reported for the first time the presence of PnMV y TMV in wild and semi-cultivated poinsettia plants from Mexico. According to the DAS-ELISA test, it is possible to consider that poinsettia is as a new host for CMV.

Master thesis

DAS-ELISA RT-PCR TMV PnMV Nochebuena de sol Wild poinsettia Fitopatología Maestría CIENCIAS AGROPECUARIAS Y BIOTECNOLOGÍA

Dinámica de la respuesta humoral específica y frecuencia de variantes del virus de PRRS en tres granjas porcinas con diferentes estrategias de control, en Yucatán, México

PILAR ANGELICA GOMEZ RUIZ JORGE CARLOS RODRIGUEZ BUENFIL CARLOS ENRIQUE PÉREZ OSORIO ALEJANDRO ALZINA LOPEZ JOSE CANDELARIO SEGURA CORREA (2014)

El objetivo de este estudio fue describir la dinámica

de la respuesta humoral específica y la frecuencia de

variantes del virus del PRRS en tres granjas con

diferentes estrategias de control. Treinta cerdos en

cada granja fueron estudiados. Los animales se

muestrearon y los sueros se procesaron mediante

ELISA y RT-PCR in tiempo real usando tecnología

Sybr Green para detectar las variantes del virus del

PRRS. La media de los valores de S/P, RT-PCR y

temperatura de desnaturalización se compararon a los

21, 49, 77,105 y 160 días de edad. Los cerdos de las

granja A fueron positivos a la prueba de ELISA en

todas las edades; en la granja B los cerdos fueron

positivos a los 77, 105 y 160 días de edad, y los

cerdos de la granja C fueron positivos a los 105 y 160

días de edad. Las temperaturas de desnaturalización,

mostraron cuatro diferentes tiempos de

desnaturalización en cada granja, correspondiendo a

cuatro tipos de virus: virus vacunal, inóculo y dos

tipos silvestres de virus. En conclusión, las diferentes

estrategias utilizadas en las granjas indujeron una

respuesta inmune en la mayoría de los animales. En la

granja A se obtuvieron las medias más altas de S/P.

Las estrategias de control no evitaron la presencia de

variantes del virus del PRRS por lo que pudieran

representar un riesgo para la población animal.

Article

BIOLOGÍA Y QUÍMICA MEDICINA Y CIENCIAS DE LA SALUD PRRS RT-PCR Sybr green Variantes

La sobreexpresión de los Genes Id es un marcador de progresión del cáncer cervocouterino

JACQUELINE JUAREZ CEPEDA (2005)

"Los genes Id codifican factores de transcripción que actúan como inhibidores de la diferenciación y promueven la proliferación celular, y su sobreexpresión se ha documentado en diversos tipos de cáncer. Id1 ha sido considerado como un marcador molecular de cáncer cervicouterino (CaCu) dado que su sobreexpresión se asocia a la disminución en la esperanza de vida de pacientes con CaCu invasor. Se desconocen los niveles de expresión de los genes Id en lesiones precursoras de CaCu. Para explorar su utilidad como marcadores de progresión en CaCu, analizamos por RT-PCR semicuantitativa la transcripción de los genes Id1, Id2 e Id3 en biopsias de lesiones cervicales intraepiteliales escamosas de bajo (LSIL) y alto grado (HSIL), precursoras de CaCu. Las HSIL sobreexpresaron marcadamente los genes Id1 (363%), Id2 (249%) e Id3 (319%) respecto al cérvix normal. Las líneas celulares HeLa y SiHa, derivadas de CaCu y usadas como control presentaron también altos niveles de transcripción para estos genes. En LSIL sólo el gen Id3 tuvo una sobreexpresión moderada (202%) respecto al tejido normal. El origen epitelial de la sobreexpresión de los genes Id se confirmó en cultivos primarios de queratinocitos cervicales derivados de LSIL. Nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión de los genes Id efectivamente es un marcador de progresión desde las etapas tempranas del CaCu."

"Id genes encode transcription factors that inhibit cell differentiation and promote cell growth and their overexpression has been shown in various types of cancer. Id1 has been considered a molecular marker of cervical cancer (CC) because its overexpression is associated with a decrease of life expectancy in patients with invasive CC. The expression levels of Id genes in preneoplastic cervical lesions are unknown. To explore their use as CC progression markers, we analyzed the transcription of Id1, Id2 and Id3 in squamous intraepithelial lesions of low (LSIL) and high (HSIL) grade, precursors of CC, by semiquantitative RT-PCR. The HSIL strongly overexpressed the Id1 (363%), Id2 (249%) and Id3 (319%) genes compared with normal cervix. HeLa and SiHa cell lines, derived from invasive CC also showed high levels of expression for these genes. In LSIL only Id3 showed a moderate overexpression (202%) compared with normal tissue. The epithelial origin Id genes overexpression was confirmed in primary cultures of cervical keratinocytes derived from LSIL. Our results suggest that the Id genes overexpression can indeed used as CC progression marker."

Master thesis

Cáncer cervicouterino Genes Id RT-PCR Semicuantitativa BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA MOLECULAR

Detección del virus de prrs en la mosca domestica (musca domestica) de una granja porcina de Yucatán, Mexico

GLADYS ISABELA NOH CUXIM (2018)

El objetivo del estudio fue detectar la presencia del virus de PRRS en la mosca doméstica, (Musca domestica) utilizando una población de cerdos alojados en una misma nave, en condiciones de campo.

Master thesis

Mosca doméstica vPRRS RT-PCR Porcinos CIENCIAS AGROPECUARIAS Y BIOTECNOLOGÍA

Optimización de métodos de análisis molecular in situ para su aplicación en hojas de plantas

IVAN TAKESHI CERRITOS CASTRO (2018)

"La Reacción en Cadena de la Polimerasa de Transcripción Inversa in situ (IS-RT-PCR por sus siglas en inglés) permite conocer la ubicación espacial de RNAm en un tejido. El Mapeo por Espectrometría de Masas con Desorción/Ionización Láser Asistida por Matriz (MALDI-MSI por sus siglas en inglés), permite conocer la ubicación espacial en un tejido, de una gran cantidad de analitos como: proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y metabolitos. Ambas técnicas son relativamente recientes y requieren de un laborioso proceso para ejecutar un análisis. Sin embargo, la cantidad de información que pueden proveer justifica el tiempo requerido. Los protocolos de preparación de muestras publicados para estos análisis tienen puntos susceptibles de mejora que harían más fácil o mejor la ejecución. En el presente trabajó se indagó en estos protocolos y se y se mejoraron algunos pasos. El principal inconveniente con el protocolo de IS-RT-PCR es la dificultad de manipular un corte histológico en laminilla. Así, en el presente trabajo se investigó la posibilidad de ejecutar el análisis en un fragmento de hoja que se conserve de epidermis a epidermis. Se logró una reacción parcial en este fragmento. En MALDI-MSI el principal punto de mejora fue mantener la integridad del corte al secarlo estando en un medio de inclusión, así como aplicar de manera homogénea la matriz. El mejor medio de inclusión fue carboximetilcelulosa al 2% en sacarosa al 9.25%. Para la aplicación de la matriz, se utilizó la impresora EPSON T50 y se encontró que el cabezal negro es capaz de despachar gotas de hasta 35 µm de diámetro de manera muy precisa. Con este resultado concluimos que el uso de la impresora T50 es adecuado y económico. En el segundo capítulo, nos enfocamos a caracterizar los cristales de oxalato de calcio presentes en hojas de amaranto."

"In situ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (IS-RT-PCR), allows to know spatial location of mRNA in a tissue. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging (MALDI-MSI) permits to know spatial publication in a tissue of a variety of analytes as: proteins, lipids, carbohydrates, nuclei acids and metabolites. Both techniques are relative recent and require a laborious process to perform one analysis. Nevertheless, the amount of information that can be obtained justifies the time required for it. Published protocols of sample preparation for these analyses have steps that can be improved in order to be easier or better performing. In this work we inquired these protocols and improve some steps. The main inconvenient with the IS-RT-PCR protocol is the difficulty of handling a histological cut on a glass slide. So in this work we investigated the performing of protocol in a leaf fragment that is preserved from epidermis to epidermis. We achieve a partial reaction in the leaf fragment. In MALDI-MSI the main improving points were keeping cut integrity while it is dried in an embedding media, and applying matrix solution in a homogenous manner. The best embedding media was 2% carboxymethylcellulose in 9.25% sucrose. For matrix application, we used an EPSON T50 inkjet printer, we found that black nozzle can dispatch drops of until 35 µm of diameter in a very precise manner. With this result we conclude that T50 printer is suitable and cheaper than commercial options. In the second chapter, we focused in characterizing calcium oxalate crystals of amaranth leaves."

Master thesis

RT-PCR in situ Mapeo MALDI Mapeo por Espectrometría de Masas Amaranto Metabolismo C3-C4 BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA MOLECULAR BIOLOGÍA MOLECULAR

Respuestas fisiológica y molecular de plantas de arroz crecidas bajo estrés osmótico

SOLEDAD GARCIA MORALES (2012)

Tesis (Doctorado en Ciencias, especialista en Edafologia).- Colegio de Postgraduados, 2012.

Las plantas están expuestas a diversos tipos de estrés abiótico incluyendo sequía y salinidad, los cuales constituyen los principales factores que limitan la productividad de los cultivos en el mundo. Para responder al estrés, las plantas han desarrollado una serie de mecanismos fisiológicos, bioquímicos y moleculares. Entre estos últimos, los factores de transcripción juegan un papel preponderante en la regulación de la expresión de genes, y su identificación y caracterización es esencial para la regulación transcripcional y conferir tolerancia al estrés. El objetivo de este trabajo fue analizar las respuestas fisiológicas de cuatro cultivares mexicanos de arroz al estrés osmótico dado por deshidratación y salinidad, así como las respuestas moleculares de dos cultivares con respuestas contrastantes a los factores de estrés, en condiciones de hidroponía. Primero se evaluaron las respuestas fisiológicas de cuatro cultivares de arroz: Cotaxtla, Tres Ríos, Temporalero y Huimanguillo, bajo deshidratación dada por la adición de 10% PEG a la solución nutritiva y salinidad ocasionada adicionando 100 mM NaCl a la solución nutritiva. El cultivar Cotaxtla resultó más tolerante al presentar menor reducción en el crecimiento y mayor síntesis de aminoácidos totales y prolina. Tres Ríos fue el cultivar más sensible, al tener mayor reducción en el crecimiento y un nulo rendimiento del fotosistema II bajo condiciones de salinidad. Usando la técnica de RT-PCR en tiempo real se realizó un tamiz de 51 genes. Al analizar la curva de disociación se seleccionaron sólo 41 genes que mostraron un pico único en la curva. Para el análisis de la expresión relativa de los genes se utilizó el método 2–ΔΔCT, con actina como gen de referencia y el testigo. La evaluación se hizo a las 6 y 24 h después de la aplicación de los tratamientos. Del análisis del perfil de expresión de los genes de interés se hallaron 11 genes inducidos por deshidratación en Cotaxtla, y 17 en Tres Ríos. Respecto a salinidad, cuatro genes fueron inducidos y seis genes reprimidos en Cotaxtla; mientras que en Tres Ríos, 30 genes fueron inducidos y dos reprimidos. Finalmente, se identificaron 10 genes candidatos (Os03g02800, Os08g33910, Os01g66490, Os01g15640, Os07g04560, Os09g33490, Os10g21560, Os03g42630, Os02g36880 y OsNAC6) involucrados en las respuestas a salinidad y tres genes (Os03g60080, Os07g04560 y Os01g59640) a deshidratación, ya que tuvieron un patrón de expresión contrastante en los dos cultivares evaluados. Estos resultados proveen evidencia de genes candidatos potencialmente involucrados en respuestas del arroz al estrés osmótico cuya caracterización subsecuente puede ayudar a descubrir nuevos mecanismos moleculares que controlan las respuestas de las plantas al estrés ocasionado por deshidratación y salinidad. _______________ PHYSIOLOGICAL AND MOLECULAR RESPONSES OF RICE PLANTS GROWN UNDER OSMOTIC STRESS. ABSTRACT: Plants are exposed to diverse kinds of abiotic stress including drought and salinity, and both drought and salinity are the major factors affecting crop productivity worldwide. To respond to abiotic stress factors, plants have developed a series of physiological, biochemical and molecular mechanisms. Among the later, transcription factors play a pivotal role in regulating gene expression, and therefore, their identification and characterization are essential for controlling gene transcription and conferring stress tolerance. Hence, this study aimed to analyze the physiological responses of four Mexican rice cultivars to osmotic stress (dehydration and sióalinity) as well as the molecular responses of two contrasting cultivars to the stress factors under hydroponic conditions. First we analyzed the physiological responses of the four Mexican rice cultivars: Cotaxtla, Tres Ríos, Temporalero and Huimanguillo under dehydration given by 10% PEG into the nutrient solution, and under salinity, adding 100 mM NaCl to the nutrient solution. Results showed that the cv. Cotaxtla was more tolerant to the osmotic stress, as plants showed less growth reduction and higher synthesis of amino acids, while Tres Ríos demonstrated to be the most sensitive cultivar, as its growth was drastically reduced in comparison to the others, and a null Photosystem II yield under salt conditions was registered. Using the real time RT-PCR technique, we performed a screening of 51 genes encoding NAC transcription factors. After analyzing the dissociation curve we selected only 41 genes showing only one pick in their respective melting curve. In order to analyze the relative expression of the genes we used the method 2–ΔΔCT, with actine as the housekeeping gene and a control gene. The evaluation was carried out 6 and 24 h after application of treatments. The expression profiling analysis of selected genes showed that 11 genes were induced by dehydration in the cv. Cotaxtla, while in Tres Ríos 17 genes were induced by the same stress factor. Concerning salinity tests, four genes were induced and six repressed in Cotaxtla, whereas in Tres Ríos 30 genes were induced and two repressed. Finally, we identified 10 genes (Os03g02800, Os08g33910, Os01g66490, Os01g15640, Os07g04560, Os09g33490, Os10g21560, Os03g42630, Os02g36880 and OsNAC6) potentially involved in salt stress responses and three genes (Os03g60080, Os07g04560 and Os01g59640) likely to be involved in dehydration responses, as those genes showed a contrasting expression pattern in both cultivars evaluated (one tolerant, the other sensitive). Our results provide evidence of candidate genes potentially involved in osmotic stress responses which subsequent characterization may help to discover novel molecular mechanisms controlling dehydration and salt stress responses.

Doctoral thesis

Sequía Deshidratación Salinidad RT-PCR en tiempo real Regulación transcripcional Drought Dehydration Salinity Transcriptional regulation Real time RT-PCR Edafología Doctorado Oryza sativa CIENCIAS AGROPECUARIAS Y BIOTECNOLOGÍA

Diseño de oligonucleótidos específicos e inéditos para la detección e identificación del virus del moteado atenuado del chile (PMMoV) en una reacción RT-PCR multiplex.

CARLOS OMAR MEDINA MOLINA (2020)

Tesis (Maestría en Ciencias, especialista en Fitopatología).- Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, 2020.

México importa semillas de chile (Capsicum annum) de China, Japón, Francia, España, Turquía, Holanda, EUA y Hungría, países donde se encuentra el virus del moteado atenuado del chile (Pepper mild mottle virus, PMMoV). Este virus ocasiona síntomas de arrugamiento, deformación, moteado amarillo o tonos verdes claros en hojas y frutos afectando la producción en el cultivo de chile. Actualmente, el diagnóstico molecular del virus PMMoV es por reacción RT-PCR usando solo un juego de oligonucleótidos que podrían favorecer la probabilidad de obtener falsos resultados, debido al potencial de mutación del virus o de la alineación de los oligonucleótidos con el genoma de otras especies del género Tobamovirus al cual pertenece el virus PMMoV. El genoma del virus PMMoV está constituido por una molécula de RNA monocatenario, de sentido positivo, con una longitud de 6357 nucleótidos, organizado en cuatro marcos de lectura abierta (ORF) que codifican proteínas esenciales para su ciclo viral. Por lo anterior, el objetivo general fue diseñar oligonucleótidos específicos e inéditos que trabajen en conjunto e hibriden el cDNA diana para la detección e identificación del virus PMMoV que puedan ser utilizados en una reacción RT-PCR multiplex para obtener una mayor especificidad y un poder aumentado de detección. Para esto se diseñaron cinco oligonucleótidos específicos e inéditos: A/A´, B/B´, C/C´, D/D´ y E/E, a partir de 13 secuencias completas disponibles en el GenBank NCBI, con tamaño mínimo de 6300 nucleótidos. De estos solamente los oligonucleótidos C/C´ y E/E´ generaron los amplicones esperados de 417 y 509 pb, respectivamente, en reacciones RT-PCR y RT-PCR multiplex, con temperatura de anillamiento de 64 °C. Los resultados obtenidos en este estudio indican que los oligonucléotidos C/C´ y E/E´ amplifican los sitios catalíticos de las proteínas 30 K, responsable de la replicación, y 17.5 K, de la cápside, respectivamente, del virus PMMoV. _______________ NOVEL SPECIES-SPECIFIC PRIMERS DESIGNED FOR A MULTIPLEX RT-PCR ASSAY FOR DETECTION AND IDENTIFICATION OF THE PEPPER MILD MOTTLE VIRUS (PMMoV). ABSTRACT: Mexico imports pepper seeds (Capsicum annum) from China, Japan, France, Spain, Turkey, the Netherlands, USA and Hungary; countries where the Pepper mild mottle virus (PMMoV) is commonly detected. This virus causes symptoms such as wrinkling, deformation and yellow or light green mottling in leaves and fruits which affects crop production. Currently, molecular diagnosis of the PMMoV virus is performed by RT-PCR using one set of primers, this could favor the probability of obtaining false results due to the mutation rates of the virus or due to alignment of said primers to the genome of other species of the genus Tobamovirus. The PMMoV virus genome is a single-stranded, positive-sense RNA molecule with a length of 6,357 nucleotides, organized into four open reading frames (ORFs) that encode essential proteins for its viral cycle. the main goal of this research was to design specific and unpublished primers that work together and hybridize to the target cDNA for the detection and identification of the PMMoV virus in order to be used in a multiplex RT-PCR reaction to obtain higher specificity and increased detection potential. To achieve this, five specific and unpublished primers were designed: A/A’, B/B’, C/C’, D/D’ and E/E’ using 13 complete genome sequences available in the GenBank database of the NCBI, with a minimum size of 6,300 nucleotides as templates. Only the C/C’ and E/E’ primer pairs generated the expected amplicons of 417 and 509 bp, respectively, in both multiplex RT-PCR and RT-PCR reactions with an annealing temperature of 64 °C. Results obtained in this study indicates that the C/C' and E/E' primer pairs amplify the catalytic sites of the 30 K protein responsible for viral replication and the 17.5 K capsid protein of the PMMoV virus, respectively.

Master thesis

Pepper mild mottle virus Oligonucléotidos PMMoV RT-PCR multiplex Primers Multiplex RT-PCR Fitopatología Maestría CIENCIAS AGROPECUARIAS Y BIOTECNOLOGÍA CIENCIAS AGRARIAS AGRONOMÍA FITOPATOLOGÍA