Author: CINDY URSULA RIVAS ARZALUZ

Detección de las caspasas 3 y 7 activas, y de algunos de sus substratos divididos, en los diferentes tipos de células germinales de la rata macho

CINDY URSULA RIVAS ARZALUZ (2014)

En las células somáticas y germinales testiculares que mueren por apoptosis, se ha reportado que las caspasas 3 y 7 activas tienen un efecto proteolítico sobre diversas proteínas. Aunque se ha descrito la expresión de las caspasas activas en los espermatozoides de diferentes especies, aún se desconoce cuál es la función de tales proteínas en los gametos masculinos. El objetivo del presente trabajo fue detectar la presencia de las caspasas 3 y 7, y de algunos de sus substratos divididos, en los espermatozoides y en los diferentes tipos de células germinales testiculares. Para inducir la expresión de las caspasas activas en los espermatozoides de conductos deferentes, obtenidos de ratas control, se utilizó imiquimod y para detectar a las caspasas activas se utilizó al inhibidor fluorescente FLICA; mientras que para inducir la apoptosis de las células germinales testiculares se inyectó, por vía intraperitoneal, pcloroanfetamina a ratas adultas. Se utilizaron anticuerpos específicos para detectar por inmunohistoquímica la presencia de la caspasa 3 y 7 activas y de los fragmentos divididos de la alfa fodrina y de PARP. La detección de los espermatozoides con expresión de las caspasas activas se realizó por citometría de flujo, mientras que la expresión de las caspasas activas y de sus fragmentos divididos en el tejido testicular se realizó por microscopía de fluorescencia y confocal. El porcentaje de espermatozoides con expresión de caspasas activas, marcadas con FLICA, fue significativamente mayor cuando la incubación se realizó en presencia del inductor imiquimod (62.7±2.99 vs 96.7±1.71). No fue posible detectar en los espermatozoides, mediante inmunocitoquímica, a las caspasas activas ni a sus proteínas blanco divididas. En el tejido testicular se detectó la expresión de las caspasas activas, y de su proteínas blanco divididas, en las espermatogonias, los espematocitos y en las espermátidas, pero no en los espermatozoides testiculares. En el caso de las espermátidas alargadas, prontas a liberarse hacia el lumen del túbulo seminífero, la marca de alfa fodrina se observó en la región de las células que da origen a la gota citoplasmática. Nuestros resultados indican que es posible detectar por inmunohistoquímica a las caspasas activas y a sus proteínas blanco divididas, y que esta marca no está presente en los espermatozoides. Lo anterior explica la no detección inmunocitoquímica de los fragmentos divididos en los espermatozoides obtenidos a partir de los conductos deferentes.

In somatic cells and testicular germ cells that die for apoptosis, it has been reported that active caspases 3 and 7 have a proteolytic effect on diverse proteins. Although expression of the active caspases in sperm of different species has been described, is still unknown the function of such proteins in the male gametes. The aim of this study was to detected the presence of caspase 3 and 7, and some of their divided substrates, in sperm and in different types of testicular germ cells. Expression of active caspases in spermatozoa of vas deferens, obtained from control rats, was induced by imiquimod and to detect the active caspases was used the fluorescent inhibitor FLICA; while induction of apoptosis of testicular germ cells was realized by an intraperitoneally injection of p-chloroamphetamine to adult rats. Specific antibodies were used to detect by immunohistochemistry the presence of active caspase 3 and 7, and the divided fragments of alpha-fodrin and PARP. The detection of the spermatozoa with expression of active caspases was realized by flow cytometry, and detection of active caspases and their divided substrates in testicular tissue was conducted by fluorescence and confocal microscopy. The percentage of sperm with expression of active caspases, increased significantly when the incubation was realized in the presence of the apoptosis inducer imiquimod (62.7±2.99 vs 96.7±1.71). Either active caspases nor their divided subtrates were detected by immunocytochemistry. In testicular tissue active caspases and their divided subtrates were observed in spermatogonia, spermatocytes and spermatids, but no in the testicular sperm. In elongated spermatids, ready to be released toward the lumen of the seminiferous tubule, immunostain of alpha fodrin was observed in the region that gives rise to the cytoplasmic droplets. Our results indicate that in testicular tissue it is possible to detect, by immunohistochemistry, to the active caspases and their divided substrates, although detection is negative in testicular sperm. The previous explains the non immunocytochemical detection of the fragments divided into the spermatozoa obtained from the vas deferens.

Master thesis

Reproducción humana Tecnología reproductiva Apoptosis Muerte celular BIOLOGÍA Y QUÍMICA